Спермоанализатор ММС Сперм (MMC Sperm): подбор оборудования

Как выбрать оборудование для автоматического анализатора качества спермы

Спермоанализатор ММС Сперм: микроскоп, цифровая камера, счетная камера, нагревательный столик.

Подбор аппаратной части для спермоанализатора

Спермоанализатор (Computer Aided/Assisted Sperm Analyzer, CASA) - программно-аппаратный комплекс для анализа качества спермы в медицине, ветеринарии, животноводстве, биологических исследованиях уже давно стал распространённым и важным инструментом в лаборатории. Анализатор спермы состоит из программного обеспечения для анализа качества спермы, установленного на компьютере, цифровой камеры, микроскопа, счётной камеры, систем контроля температуры. Важной частью анализа спермы также является пробоподготовка и работа с красителями. Ниже мы опишем логику подбора аппаратной части для спермоанализатора.

Анализаторы спермы можно разделить на два типа:

"Коробочные" приборы, где цифровая камера, оптика, иногда даже и ПК, помещены в единый корпус.
Программно-аппаратные комплексы, позволяющие выбирать компьютер для установки ПО, цифровую камеру, счётную камеру, микроскоп и другие компоненты в зависимости от задач и бюджета пользователя.

Преимущества программно-аппаратного комплекса перед "коробочными" анализаторами

Выбор

Вы можете подобрать все компоненты аппаратного обеспечения спермоанализатора в соответствии с задачами и имеющимся бюджетом.

Использование имеющегося оборудования

Можно использовать Ваш микроскоп и другие компоненты, если они соответствует требованиям для анализатора спермы.

Универсальность компонентов

Микроскоп и цифровую камеру можно применять не только для спермоанализа, но и для решения любых других задач (см. база данных MultiMedia Catalog).

Функциональность

Программное обеспечение для анализа спермы имеет гораздо больше функциональных возможностей, чем "коробочный" анализатор (концентрация, подвижность, жизнеспособность, морфология, фрагментация ДНК, ведение базы данных – всё на одном приборе).

Расходные материалы

Можно выбирать уровень использования расходных материалов, увеличивающих себестоимость анализа (многоразовая счетная камера при небольшом объёме анализов или одноразовые стёкла).

Гибкость

Полноценное программное обеспечение для анализа изображений подстраивается под работу с более дешёвыми красителями, так, например, в программе ММС Сперм вместо дорогих флуоресцентных красителей мы предлагаем настройки под недорогой Eosin Y для жизнеспособности, Diff-Quik для морфологии, недорогие наборы для исследования фрагментации ДНК сперматозоидов на основе дисперсии хроматина (Sperm Chromatin Dispersion).

Однако к аппаратной части предъявляется ряд требований, которые мы раскроем ниже с объяснением, чем они обусловлены. Так будет яснее логика подбора оборудования и все связанные с ней детали.

Микроскоп для спермоанализа

Требуется тринокулярный микроскоп проходящего света со светодиодным осветителем, светоделителем 100/0, 1x C-Mount адаптером для подключения цифровой камеры, объектив 10х (рекомендуется негативный фазовый контраст) для анализа подвижности сперматозоидов, объектив 40х, светлое поле, для анализа жизнеспособности и фрагментации ДНК, объектив 100х светлопольный, масляной иммерсии для анализа морфологии.

Спермоанализатор MMC Сперм

Сборка биологического микроскопа для спермоанализа

Требования к микроскопу для спермоанализа

Методы контрастирования для анализа подвижности сперматозоидов

Анализатор спермы ММС Сперм может работать как с тёмными объектами на светлом фоне (светлое поле), так и со светлыми на тёмном (позитивный или негативный фазовый контраст). Рассмотрим преимущества и недостатки всех методов.

Негативный фазовый контраст

Негативный фазовый контраст - оптимальный метод контрастирования для оценки подвижности сперматозоидов. При использовании негативного ФК сперматозоиды отображаются в виде светлых объектов на контрастном тёмном фоне. Свет полностью повторяет форму головки сперматозоида, большинство посторонних объектов не мешают выделению.

Сперматозоиды быка, негативный фазовый контраст на микроскопе Nikon E200 (ECLIPSE 200), объектив CFI Achromat BM 10X, N.A. 0.25 WD=7.0mm

Пример оценки подвижности в негативном фазовом контрасте

Слева - исходное изображение (кадр видеоролика, записанного в программе ММС Сперм), справа - результат отслеживания движения сперматозоидов и классификация.

Светлое поле

Для работы в светлом поле необходимо немного расфокусировать изображение головок сперматозоидов, чтобы получить равномерно тёмные объекты на светлом фоне. Однако, при работе в светлом поле программа может выделять посторонние объекты, похожие по форме на сперматозоиды, и классифицировать соответствующим образом, что приводит к завышению концентрации неподвижных спермиев. При использовании фазового контраста этот эффект наблюдается в значительно меньшей степени, поэтому, при возможности, лучше использовать негативный фазовый контраст.

Позитивный фазовый контраст

Позитивный ФК представляет сперматозоиды в виде тёмных объектов со светлым пятном посередине головки. Этот метод позволяет отсечь посторонние объекты, но в связи с тем, что свет не закрывает головку целиком, снижается роль параметра формы головки для распознавания сперматозоидов. Кроме того, при позитивном фазовом контрасте вокруг головок могут образовываться световые ореолы, которые также могут мешать выделению. Рекомендуем использовать негативный фазовый контраст.

Рекомендуемые модели микроскопов для спермоанализа

Настройка микроскопа

При использовании микроскопа в составе любой системы анализа изображений необходимо уделить особое внимание настройке микроскопа, поскольку любая программа анализирует изображение, полученное с микроскопа, а не сам препарат. Любые недочеты в настройке могут привести к получению неверного результата. В этом плане спермоанализатор - не исключение. Не забывайте о том, что конечной целью настройки является качественное изображение на сенсоре камеры, поэтому ключевые этапы настройки необходимо проводить, глядя на экран компьютера, а не в бинокуляр микроскопа. Настройка фазовоконтрастного микроскопа для спермоанализа показана на видео.

Счетные камеры

При анализе подвижности сперматозоидов необходимо использовать специальные счётные камеры:

Счётная камера глубиной 10 микрон позволяет сперматозоидам свободно двигаться и располагает их примерно в одной плоскости для равномерной фокусировки стандартного объектива 10x. Использование счётных камер глубиной более 15 микрон для анализа подвижности человеческих сперматозоидов и сперматозоидов многих видов животных и рыб не рекомендуется, поскольку сперматозоиды будут выходить за пределы глубины резкости объектива 10х. Более глубокие камеры применяются только для оценки подвижности тех видов, у которых средние размеры головки сперматозоида значительно превышают человеческие.
При большом объёме анализов имеет смысл использовать одноразовые стёкла - это удобно, экономит время. Одноразовые стёкла необходимо использовать при работе с заразной спермой (гепатит и т.п.). Необходимо также отметить, что многоразовые счётные камеры в силу особенностей производственного процесса значительно толще обычных предметных стёкол, и поднимают объект на высоту, которая может выходить за пределы рабочего расстояние конденсоров микроскопов. Рекомендуем использовать одноразовые стёкла.
Многоразовые счётные камеры подходят при небольших объёмах анализов. Ведущим производителем и изобретателем многоразовых камер для анализа спермы является израильская компания Sefi Medical. Их "камера Маклера" заслуженно считается стандартом в этой области. К сожалению, стоит камера Маклера достаточно дорого. Мы рекомендуем использовать взамен недорогие одноразовые счётные стёкла.

Типы одноразовых счётных стёкол

Одноразовые стёкла можно разделить на два типа:

Стёкла с фиксированным покровным стеклом. Преимущества фиксированного стекла в том, что оно позволяет точно соблюдать глубину камеры. Но есть и большой недостаток: камера заполняется спермой под действием капиллярных сил, что приводит к образованию потока спермы по центру камеры и влияет на результаты анализа подвижности. Поток разгоняет сперматозиды и они дрейфуют быстрее, чем плыли бы в неподвижной среде. Возникает так называемый "эффект Сегре – Зильберберга" (Segré–Silberberg effect), который необходимо учитывать при анализе, применяя определённые коэффициенты. Чтобы нивелировать это проблему, приходится ждать, пока сперматозоиды равномерно распределятся по камере. Таким образом сходит на нет та экономия времени, ради которой используются одноразовые стёкла. Стёкла такого типа производят компании Leja, Cell-Vu и многие другие. Стоит обратить внимание на технологию нидерландской компании Leja, которая добавляет в клей, фиксирующий покровные стёкла, твёрдые калиброванные шарики диаметром 10 микрон, что обеспечивает высокую точность соблюдения глубины камеры. Однако эта дорогостоящая технология отражается на стоимости стёкол.
Стёкла с накладным покровным стеклом. Это стёкла, на которых с помощью точного принтера или иным способом наносятся дорожки высотой 10 микрон. Покровные стёкла кладутся сверху и опираются на дорожки, образую счётную камеру. Таким образом эффекты, возникающие под воздействием капиллярных сил, полностью отсутствуют. Недостатком такой технологии является то, что под стекло может попасть пылинка и изменить глубину камеры. Перед использованием такие счётные камеры и покровные стёкла стоит обдувать феном. Однако преимущества такого типа очевидны: их можно использовать сразу. Кроме того, себестоимость их производства значительно ниже, что отражается на цене. Мы предлагаем стёкла именно такого типа.

Количество камер на одноразовом счётном стекле

На одноразовых счётных стёклах обоих типов (фиксированное стекло - накладное стекло) может быть расположено от одной до 6ти и даже 8ми камер. Какое количество камер оптимально? Очевидно, что, чем больше камер, тем меньше будет себестоимость анализа. В случае исследовательской работы это действительно так. Однако, большим преимуществом одноразовых стёкол в клинической практике является использование одного стекла на пациента и маркировка стёкол для "закрепления" их за конкретным пациентом, дабы избежать путаницы. В этом случае оптимальное количество камер на стекле - две камеры. Если камер будет больше, лаборант может перепутать образцы. Кроме того, по рекомендациям ВОЗ необходимо проводить два анализа на двух каплях образца и регистрировать среднее значение. Спермоанализатор ММС Сперм позволит Вам проводить анализы по рекомендациям ВОЗ.

Системы контроля температуры

Поскольку нормальная температура человеческого тела составляет 36,6 градусов, для адекватной оценки подвижности человеческих сперматозоидов необходимо использовать системы контроля температуры образца. Основные типы таких систем:

Нагревательная плитка. Это отдельная нагревательная панель с контроллером, на которой размещаются все объекты, которые будут соприкасаться со спермой: контейнеры для хранения образца, съёмные наконечники пипеток, счётные стёкла или многоразовые счётные камеры. Такой прибор рекомендуется к использованию в составе спермоанализатора ММС Сперм. Точность поддержания температуры должна быть около 2ух градусов. Нагревательные поверхности могут иметь разный размер в зависимости от потока анализов. Мы предлагаем надёжную нагревательную плитку российского производства в различных вариантах исполнения.
Нагревательная пластина на столик микроскопа. Это пластина с контроллером для поддержания температуры образца в процессе анализа. Такие устройства рекомендуются к использованию в исследовательских экспериментах. В клинической практике обычно достаточно нагревательной плитки. Анализ в программе ММС Сперм происходит быстро, кроме того, можно анализировать записанные предварительно видеоролики. В связи с этим нагревательные пластины на предметном столике микроскопа используются не очень часто.

При анализе спермы животных, рыб, насекомых могут использоваться охлаждающие и нагревательные системы различных модификаций.

Красители и пробоподготовка

Подвижность: пробоподготовка

Обычно пробоподготовка заключается в аккуратном размешивании препарата, что позволяет распределить сперматозоиды равномерно. При этом нужно избегать появления пузырьков. Если в препарате повышенный уровень слизи, можно несколько раз пропустить его через толстую иголку шприца для достижения более равномерной консистенции.
При высокой концентрации сперматозоидов может возникнуть ситуация, при которой анализ подвижности затрудняется в связи с тем, что сперматозоиды часто сталкиваются друг с другом. В этом случае необходимо разбавить сперму до достижения приемлемой концентрации.

Морфология: пробоподготовка

Для получения качественных изображений препаратов при оценке морфологии сперматозоидов необходима определенная подготовка. Для того чтобы избавиться от возможных посторонних объектов, нужно разбавить сперму и удалить семенную плазму путем центрифугирования. Образец разбавляют соответствующим объемом физиологического раствора для достижения максимальной концентрации, но не более 80 x 10^6/ml. Препарат в объеме кратном 0.2-0.5 ml, в зависимости от концентрации, разбавляют до 10 ml физиологическим раствором комнатной температуры. Пробирка центрифугируется при 800g в течение 10 минут, большая часть надосадочной фракции удаляется. Осадок размешивают в остатках физраствора, обычно 20-40 µl, аккуратно взбалтывая пробирку. Далее 5-10 µl полученной суспензии помещаются на предметное стекло микроскопа, и капля распределяется по стеклу.
Настройки программы ММС Сперм позволяют проводить анализ на образце без применения центрифугирования, но это затрудняет работу, поскольку на таком образце прокрашиваются элементы фона. См. изображения в галерее.

Приготовление мазков

На случай проблем с окраской необходимо подготовить как минимум два мазка из свежего образца спермы. Стекла должны быть тщательно очищены и промыты в 70% этиловом спиртe. Затем капля образца (от 5 до 20 µl) помещается на стекло. Если концентрация спермы, установленная по методике Подвижность превышает 20 x 10^6/ml, то можно использовать 5 µl спермы. Если концентрация меньше 20 X 10^6/ml, то потребуется капля 10-20 µl. Технику с использованием второго стекла (см. рисунок) нужно применять осторожно, чтобы не повредить сперматозоиды, а также следить за тем, чтобы мазок не был слишком толстым. Эта техника хорошо подходит для образцов с низкой вязкостью. Можно так же поступить следующим образом: поместив каплю на одно стекло, накрыть его вторым и подождать, пока сперма распределится между стеклами, затем аккуратно разделить стекла. В результате Вы получите два мазка.

Visual communication

Краcитель Diff-Quik

Программа ММС Сперм настроена на работу с красителем Дифф-Квик (Diff-Quik). Краситель Diff-Quik рекомендован ВОЗ и является распространенным методом быстрой окраски сперматозоидов. Обычно набор Diff-Quik имеет следующий состав:

Фиксатор, раствор триарилметана в метаноле.
Краситель номер 1, красный: ксантин (eosinophilic xanthene).
Краситель номер 2, синий: тиазин (basophilic thiazine).

Применение красителей типа Diff-Quik:

Мазок, приготовленный, как описано выше, погрузить в фиксатор на 15 секунд.
Промокнуть избытки раствора, поставив стекло вертикально на бумагу.
Погрузить в краситель номер 1 на 10 секунд.
Промокнуть избытки раствора, поставив стекло вертикально на бумагу.
Погрузить в краситель номер 2 на 5 секунд.
Промыть стекло под струей воды 10-15 раз для удаления излишков красителя.

Для получения хорошей окраски, пожалуйста, следуйте инструкциям производителя Вашего набора Diff-Quik!

Visual communication

Жизнеспособность: пробоподготовка

Анализатор качества спермы ММС Сперм имеет два режима анализа жизнеспособности сперматозоидов: ручной и автоматический. В ручном режиме может использоваться любая окраска: эозин, эозин-нигрозин, гипоосмотическое набухание или флуоресцентные красители. Автоматический анализ настроен на использование красителя эозин Y (Eosin Y, цветовой показатель 45380) - это самый простой, быстрый и доступный метод окраски сперматозоидов. Подготовка реагентов:

NaCl, 0,9% (w/v): растворите 0,9 г NaCl в 100 мл дистиллированной воды.
Эозин Y, 0,5% (w/v): растворите 0,5 г эозина Y (цветовой показатель 45380) в 100 мл 0,9% NaCl.
Если вы используете водный раствор эозина, имейте в виду, что некоторые растворы эозина являются гипотоническими водными растворами. Они могут негативно повлиять на сперматозоиды и привести к получению ложноположительных результатов. При применении подобных растворов добавьте 0,9 г NaCl к 100 мл раствора для увеличения осмолярности.

Процедура:

Тщательно перемешайте образец спермы.
Смешайте 5 мкл образца спермы с 5 мкл раствора эозина.
Подготовьте мазок на стекле, как описано выше в разделе пробоподготовки для оценки морфологии сперматозоидов.

Получить консультацию

Сообщите ваши контакты, наши менеджеры свяжутся с вами и помогут подобрать необходимое программное обеспечение или оборудование.

Нажимая на кнопку, вы соглашаетесь с правилами обработки персональных данных